Approccio alla peritonite infettiva felina

Quanti coronavirus esistono? Come si realizza la patogenesi?
In passato ci si esprimeva in modo semplicistico considerando la presenza di un Coronavirus a localizzazione enterica (FeCV, non patogeno) e di un Coronavirus (FIPV, patogeno) a diffusione sistemica. In realtà la situazione è molto più complessa: durante la replicazione virale, in particolare nelle prime fasi dell’infezione, quando la carica è maggiore, si verificano numerose mutazioni spontanee, che permettono la comparsa di varianti a minore capacità replicativa nell’intestino, ma con maggiore tropismo verso monociti e macrofagi, ove si replicano.

I mononucleati infetti trasportano il virus fino a degli organi bersaglio, la maggior parte dei quali sono irrorati dall’arteria mesenterica craniale e/o sono ricchi di fagociti: linfonodi mesenterici, superfici sierose intestinali, pleura, omento, meningi ed ependima, dura madre, uvea e retina.

Se il gatto è in grado di reagire con una adeguata risposta immunitaria cellulo-mediata il virus può rimanere confinato nei macrofagi anche a vita, oppure l’infezione  può cessare. La combinazione di fattori virali, genetici, individuali (età), stress ambientali e altri fattori possono in altri casi permettere la replicazione  virale di una forma mutata. La comparsa di una reazione  umorale, con anticorpi sieroneutralizzanti (inibenti in vitro, ma facilitanti in vivo) concorre in modo rilevante all’insorgenza della malattia: i complessi Ag-Ab vengono immediatamente fagocitati dai monociti, si riduce la presenza di Ag circolante e il virus si trasmette per contatto da cellula a cellula.

E’ da notare anche che il FeCV può generare viremie transitorie e può localizzarsi, in assenza di stati di malattia, in vari organi e tessuti.


Quando si infettano i gattini?

L’età dell’infezione è circa a 9 settimane, legata al declino degli anticorpi materni che generalmente sono efficaci fino alla 5a-6a settimana di vita. Di questo fenomeno si può tenere conto per una prevenzione, che si può realizzare separando precocemente i gattini dalla madre, solitamente è responsabile dell’infezione stessa. Uno svezzamento precoce, da eseguire a circa 5-6 settimane di età, si associa però inevitabilmente ad alterazioni comportamentali legate alla mancanza della figura materna. Si intende che i gattini separati dalla madre debbano essere ricollocati in strutture ove sia certa l’assenza del coronavirus (ovvero dove non siano presenti altri gatti).


Quali sono le età più colpite?
Manifestano la malattia prevalentemente gatti di età inferiore ai 3 anni, in particolare tra i 4 e i 16 mesi. Esiste un II picco di età tra 120 e 180 mesi. Seppur più raramente può comparire in gatti di ogni età.


Dopo che un gatto è deceduto per FIP, per quanto tempo il virus rimane infettante nell’ambiente?
Pur considerando che il virus viene inattivato dai comuni disinfettanti ambientali, può persistere in un ambiente secco fino a 7 settimane.

Esistono le epidemie di FIP ?
La trasmissione del virus della FIP da gatto a gatto, con sviluppo di forme cliniche in forma epidemica, è estremamente rara. Perché il virus della FIP è a scarsa contagiosità, mentre il virus enterico si diffonde con estrema facilità ? La spiegazione è probabilmente data da una mutazione a carico del gene 3c che è stata notata nel virus della FIP. Questo gene, quando è integro, permette la caratteristica e abbondante replicazione intestinale del virus nella sua forma enterica, che si associa ad elevata contagiosità.

Perché la presentazione clinica varia da una forma umida ad una secca ?
La differenza è legata alla tipologia della risposta immune, anche quando insufficiente a contenere il virus. Le forme umide sono associate ad una risposta umorale e si sviluppa una polisierosite, legata ad una infiammazione vascolare con componente macrofagica. La forma secca invece riguarda lesioni granulomatose, quindi legate ad una maggiore risposta cellulo-mediata.

La forma umida, classica, è più facile da riconoscere. Le forme secche invece come si presentano ?
Si deve partire dalla considerazione che non si tratta di due forme totalmente distinte: ad esempio in molte forme secche compare una modica quantità di essudato perilesionale. Le manifestazioni cliniche sono legate alla localizzazione della vasculite e della lesione piogranulomatosa. Una localizzazione che può creare enormi difficoltà in fase diagnostica è data dalla presenza nella parete del colon di lesioni  granulomatose, che possono evolvere fino a generare una  rottura del viscere, con complicazione  di un essudato settico polimicrobico. Le lesioni possono anche  localizzarsi nella cute con aspetto nodulare multiplo e fragilità cutanea.

Esistono forme subcliniche e croniche ?
A complicare in modo rilevante il quadro clinico e l’utilizzo diagnostico della PCR è da considerare che il virus della FIP può essere isolato nei linfonodi mesenterici anche per lunghi periodi. L’infezione può cessare o evolvere in FIP.

L’evoluzione della malattia è sempre progressiva ?
Sono descritti dei rarissimi casi di guarigione spontanea; inoltre sono segnalate temporanee remissioni, con ricadute fatali dopo mesi o anni.

Quali sono le principali alterazioni negli esami di laboratorio ?
La FIP è una delle principali malattie a carattere infiammatorio dei felini. Pertanto il clinico deve disporre di adeguati parametri biochimici che riflettano tale flogosi e che vengono denominati proteine di fase acuta. Un ottimo test, che dovrebbe a nostro parere essere sempre presente nelle indagini di laboratorio, è la determinazione dell’amiloide sierica (SAA). Invariabilmente si presenta aumentata di almeno 20 v. oltre il limite massimo. Le proteine totali sono molto frequentemente aumentate a causa di una condizione di iperglobulinemia, solitamente policlonale (figura 1) e il rapporto albumine:globuline è diminuito.

Figure 1 Elettroforesi sierica microcapillare di gatto affetto da FIP

 

A riflettere lo stato iperossidativo descritto nella FIP, si può osservare una diminuzione della paraxonase 1 (PON1), come in altre patologie infiammatorie, ed una peculiare diminuzione della capacità antiossidante totale (TAC).

Qual è il significato diagnostico della alfa1-glicoproteina acida ?
La alfa1-glicoproteina acida è un’altra proteina di fase acuta e si presenta aumentata in caso di FIP al pari, ad esempio della SAA. Citando una recente review (ABCD, 2012), elevati livelli di AGP (ad es. > 3 mg/ml, con un test) possono supportare la diagnosi di FIP, ma possono presentarsi anche in altre patologie infiammatorie. Inoltre l’AGP può aumentare anche in gatti asintomatici e infetti dal FCoV, soprattutto in ambienti ove l’infezione sia endemica[1].

Nella pratica dell’Autore la determinazione dell’AGP non è compresa nell’approccio diagnostico alla FIP.

Che indagini possono essere eseguite nei versamenti pleurici o peritoneali ?

Figure 2 Dilatazione addominale secondaria a versamento in gatto Maine Coon di 5 mesi di età

 

Partendo dal fatto che il versamento deve sempre essere indagato dal punto di vista citochimico e non ci si può basare sull’aspetto macroscopico per emettere una diagnosi di FIP, le indagini minime da eseguire sono la determinazione delle proteine totali, che devono riflettere il carattere essudativo (> 3.5 gr/dL), a fronte di una popolazione cellulare scarsa. L’esame citopatologico rivela uno sfondo proteinaceo corpuscolato, con presenza di mononucleati e granulociti neutrofili. Il fluido può anche  essere di natura chilosa; tale caratteristica viene accertata misurando colesterolo e trigliceridi nel fluido e comparandoli con quelli ematici (in caso di chilo i trigliceridi sono in concentrazioni superiori nel fluido rispetto al plasma).

L’analisi del versamento è fondamentale per escludere altre condizioni in grado di generare raccolte, quali colangiti, linfomi, cardiopatie, versamenti chilosi ed essudati settici.

Nei versamenti può essere eseguita l’elettroforesi proteica, ma a nostro parere tale indagine non offre particolari informazioni rispetto ad una elettroforesi sierica. Nella letteratura è citata la prova di Rivalta, che permette di confermare la natura essudatizia del versamento tramite una reazione di precipitazione dell’acido acetico. Il test è positivo in presenza di fibrinogeno e altre proteine infiammatorie.

I versamenti vengono comunemente utilizzati per le indagini di biologia molecolare (vedi oltre).

Ruolo diagnostico della PCR Real Time (quantitative Reverse-transcriptase PCR, qRT-PCR)
La biologia molecolare ha rivoluzionato l’approccio diagnostico a molte malattie infettive, caratterizzandosi in particolare per la elevatissima specificità. Ad esempio una PCR eseguita correttamente per Ehrlichia canistestimonia invariabilmente la presenza dell’agente infettivo e la positività si associa solitamente a malattia. Nel caso dei Coronavirus la condizione è totalmente differente, perché è comune la presenza di Coronavirus in ambito intestinale e a volte anche nel sangue periferico e in organi e tessuti. La qRT-PCR comunemente utilizzata non è in grado di distinguere questo virus dalla versione mutata, agente della FIP. Ne consegue che il significato clinico varia con la sede del campionamento e con la comparazione dei risultati a partire dai differenti substrati, partendo dal fatto che in generale una qRT-PCR positiva per Coronavirus non è sinonimo di FIP. Di seguito vengono presentate le possibili applicazioni della qPCR. Alcune considerazioni che verranno qui presentate riflettono le esperienze dell’Autore e non coincidono con quanto riferito nella letteratura corrente, che il Lettore è invitato a consultare.

Stato di portatore: la PCR su tampone fecale o feci rappresenta un metodo ideale per riconoscere i gatti portatori e di conseguenza disseminatori. Tale indagine può essere richiesta da allevatori per definire impreviste positività sierologiche o motivare quadri clinici in gattini nati da soggetti teoricamente indenni. Sono richiesti tre test consecutivi negativi, in gatti tenuti isolati, nell’ambito di 2-3 mesi, per riconosce la cessazione di uno stato di portatore. Nuove escrezioni sono comunque  sempre possibili. Il test su feci non offre alcuna informazione se si sospetta una FIP.

Esame di un versamento: la ricerca del RNA virale nel fluido è a nostro avviso, in pazienti con quadro clinico ed esami di laboratorio compatibili, una metodica valida per la diagnosi di FIP. Pur ammettendo che il paziente sia affetto da altra patologia e che casualmente vi sia del coronavirus enterico nel circolo periferico che arrivi al fluido campionato, è certo che la quantità di virus, in questo caso sia minima, mentre nelle forme essudative secondarie a FIP, con la qPCR si osservano altissimi titoli virali. Sarà quindi la quantificazione del virus, permessa dalla metodica Real Time, a discriminare tra una presenza casuale di un FCoV e una FIP “umida”. Si suggerisce contestualmente di eseguire la ricerca del virus anche su sangue intero in K3EDTA. Solitamente in caso di FIP è positivo il versamento ma non il sangue (osservazione personale). Si deve infine considerare che esistono falsi negativi, ovvero versamenti associati a FIP nei quali la qRT-PCR è negativa, per sequestro del virus all’interno delle lesioni granulomatose o per essudazione di plasma non infetto a causa di gravi lesioni endoteliali.

Esame di una lesione granulomatosa (ad es. localizzata in un linfonodo, o fegato, o rene, o milza): partendo da gatti affetti da uno stato infiammatorio sistemico e in assenza di altre cause evidenti, in caso di FIP “secca”, la quantità di virus ottenibile dalla siringa è molto alta. Ovviamente si suggerisce contestualmente di eseguire anche, con un’altra siringa, un’aspirazione per ottenere dei campioni citopatologici. Si suggerisce contestualmente di eseguire la ricerca del virus anche su sangue intero in K3EDTA. Solitamente in caso di FIP è positivo l’ago aspirato ma non il sangue (osservazione personale).

Esistono delle indagini molecolari che permettano la distinzione del virus della FIP da quello enterico ?
Nell’ultimo decennio sono state realizzate varie metodiche di biologia molecolare, in particolare con tecnologia Real Time, che permettono di individuare e quantificare il Coronavirus felino nelle feci, nel sangue, in fluidi biologici e nei tessuti. Più complessa, e oggetto di intensa ricerca, è la realizzazione di test diretti al reperimento di forme mutate che siano sicuramente associate alla malattia e permettano finalmente di offrire una indagine clinica conclusiva in pazienti non deceduti. A dimostrazione della estrema complessità dell’argomento si può citare il lavoro di Chang et al. (2012), che ha individuato due mutazioni nelle sequenze amminoacidiche della proteina spike (S), che permettono di distinguere il virus della FIP dal FeCV nel 95% dei casi ed oltre. Più recentemente un altro gruppo di lavoro ha individuato un’altra mutazione utilizzabile a fini diagnostici, sempre nella proteina S, mentre le mutazioni prima citate non erano associate alla patogenicità del virus (Porter et al., 2014).

Un altro approccio era stato definito ricercando del RNA virale che fosse presente esclusivamente nella  fase replicativa (ad es. mRNA), partendo da tessuti extraintestinali, ove non era prevista la presenza del FeCV. L’interesse per questo test, tuttora comunque disponibile, è però scemato perché si è notato che il FeCV è in grado di replicarsi anche fuori dall’intestino.

Qual è il ruolo diagnostico della ricerca degli anticorpi per Coronavirus
Se le indagini dirette non sono in grado di distinguere tra Coronavirus patogeni o non patogeni, tanto più aspecifica è la risposta anticorpale alle infezioni. Sia i gatti portatori cronici che gli ammalati sono sieropositivi, con indagini sia IFAT che ELISA e non esiste un test sierologico che permetta di diagnosticare la FIP. In generale titoli molto elevati (ad es. ≥ 1:3200) si associano ad una forma clinica di FIP, ma titoli bassi o medi non permettono di escludere la malattia, se si considera che vi sono anche gatti ammalati sieronegativi, in particolare nelle forme più gravi. A nostro parere l’uso clinico del titolo sierologico, anche considerando l’imprecisione implicita nelle determinazioni dei titoli anticorpali con le tecniche IFAT, è molto limitato. Si rimanda al lavoro di Addie et al. (2015) per una estesa valutazione relativa all’utilità dei dosaggi anticorpali, eseguibili anche con test rapidi ambulatoriali.

Qual è il gold standard per la diagnosi di FIP ?
La diagnosi definitiva si ottiene con un esame istopatologico a carico del tessuto affetto dalla malattia, che deve individuare  il tipico pattern della perivasculite piogranulomatosa.

Figure 3 Polmone: vaso venoso con parete espansa dalla presenza di numerosi macrofagi e neutrofili frammisti a più rari detriti cellulari ed a sporadici eritrociti. L’endotelio è rigonfio e prominente nel lume vascolare. Vasculite (venulite) piogranulomatosa. Cortesia Dott. G. Mezzalira, Lab. An. Vet. San Marco.

 

A partire da questa lesione si esegue una indagine immunoistochimica, che deve portare alla individuazione dell’antigene dentro i macrofagi. Anche se comunemente ci si riferisce a campioni raccolti post-mortem, in realtà si possono realizzare campioni bioptici idonei anche durante studi clinici, ad esempio biopsie a carico del mesentere, dei linfonodi mesenterici o del fegato.

C’è qualche terapia all’orizzonte ?
Nei decenni sono state tentate alcune terapie antivirali, ma ad oggi nessuna di esse si è stata approvata per un uso clinico, con la parziale eccezione dell’interferone felino, che però in uno studio controllato non ha dimostrato una reale efficacia. Le terapie più utilizzate sono invece di natura palliativa e sono dirette ad una attenuazione della risposta infiammatoria associata alla progressione della malattia. I corticosteroidi sono i farmaci più idonei per una terapia immunosoppressiva. Sono stati anche utilizzati la ciclosporina (che possiede anche una attività antivirale), la pentossifillina (come antivasculitico), antineoplastici alchilanti (ciclofosfamide e clorambucile) e anti-infiammatori quali l’acido acetilsalicilico. Negli USA ha acquisito una certa popolarità un immunostimolante chiamato Polyprenyl Immunostimulant (per la forma secca), ma gli specialisti nordamericani non reputano sufficienti i dati fino ad ora acquisiti per promuoverne l’uso.

Negli ultimi mesi è possibile l’utilizzo di un antivirale chiamato GS-441524.

Maggiori informazioni relative alle terapie sono disponibili nel sito ABCD[2].

La FIP si può prevenire ?
Partiamo dal fatto che probabilmente in tutte le comunità di gatti indoor con almeno 6 gatti è presente il FeCV in forma endemica. Inoltre il virus è presente nel 60% dei gatti che vivono in comunità. Fortunatamente a questa enorme diffusione corrisponde una incidenza molto bassa di FIP, anche se i casi sporadici creano comunque rilevanti problematiche agli allevatori e grandi conflittualità con i destinatari dei cuccioli, a causa della possibile comparsa della malattia entro poche settimane dall’adozione. Politiche di “test and remove” sono difficilmente applicabili, considerando la diffusione del virus e le innumerevoli occasioni di contagio (mostre, accoppiamenti). Inoltre gatti che si sono negativizzati possono reinfettarsi, perché l’immunità non è protettiva. Probabilmente la migliore procedura profilattica è data dalla riduzione degli effettivi negli allevamenti, perché il sovraffollamento è uno dei principali stressori per i gatti. E’ molto importante anche disporre di numerose lettiere, da pulire con sollecitudine.

 

Per approfondire

Addie DD et al. (2015), Utility of feline coronavirus antibody tests, Journal of Feline Medicine and Surgery, 17, 2, 152–162

Chang H-W et al. (2012), Spike Protein Fusion Peptide and Feline Coronavirus Virulence, Emerging Infectious Diseases, 18, 7, 1089-1095

European Advisory Board on Cat Diseases ABCD (2012), Feline Infectious Peritonitis, http://www.abcd-vets.org/Guidelines/Pages/en/1201/Feline_Infectious_Peritonitis.aspx

Kipar A & Meli ML (2014), Feline infectious peritonitis: still an enigma ? Veterinary Pathology, 51, 505-526.

Pedersen NC (2014a), An update on feline infectious peritonitis: virology and immunopathogenesis, The Veterinary Journal, 201, 123–132

Pedersen NC (2014b), An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics, The Veterinary Journal, 201, 133–141

Porter E et al. (2014), Amino acid changes in the spike protein of feline coronavirus correlate with systemic spread of virus from the intestine and not with feline infectious peritonitis, Veterinary Research, 45:49

Tecles F et al. (2015), Serum biomarkers of oxidative stress in cats with feline infectious peritonitis, Research in Vet. Science, in stampa