Come utilizzare e interpretare i test diagnostici e di monitoraggio per la leshmaniosi canina

ILa leishmaniosi è una malattia zoonotica diffusa nei paesi del Mediterraneo, causata dal protozoo Leishmania Infantum e trasmessa da insetti ematofagi del genere Phlebotomus, comunemente chiamati "pappatacei" o flebotomi. Questa patologia colpisce principalmente i cani, che rappresentano il principale serbatoio dell'infezione, ma può essere trasmessa anche all'uomo, causando forme viscerali o cutanee.

Trasmissione e ciclo dell'infezione

Il ciclo di trasmissione di L. Infantum inizia quando un flebotomo infetto punge un cane infetto e assume il parassita sotto forma di amastigote. Nei successivi 4-20 giorni, all’interno del pappataceo il parassita si replica e si trasforma nella forma infettante, promastigote, che può essere trasmessa ad altri cani, esseri umani o specie sensibili attraverso una nuova puntura. Qui viene fagocitato dai macrofagi, ritornando nella forma amastigote, al cui interno si moltiplicano per scissione binaria fino a rottura della cellula e diffusione nel sangue, per parassitare altri macrofagi e dando luogo alla forma intettante.

Sintomatologia nel cane

Il periodo di incubazione nel cane può durare anche molti anni. In alcuni casi, animali infetti non manifestano clinicamente la malattia e può rimanere asintomatico per tutta la vita, mentre in corso di manifestazione clinica, i sintomi sono molto variabili, interessano tutti gli organi, e vengono normalmente distinti in viscerali e cutanei.

FATTORI CHE INFLUENZANO LA RISPOSTA DEI TEST DIAGNOSTICI DI LABORATORIO

Risposta umorale

La progressione dell'infezione da uno stato di portatore ad una forma clinica dipende da diversi fattori che influenzano il tipo di risposta immunitaria.

Th1, Il-2 e interferon gamma, attivano i macrofagi e neutralizzano il parassita oppure arrivano ad un equilibrio per cui leishmania resta allo stato latente. Cani infetti e asintomatici mostrano una risposta cellulo-mediata intensa, mentre quelli sintomatici possiedono una riposta immunitaria prevalentemente umorale. Th2, con aumento IL-4 e IL-10 e diminuzione di IL-2, determinano la soppressione dei macrofagi e stimolazione linfociti B con aumento policlonale produzione di AC. Il continuo stimolo del parassita sul sistema immunitario turba l’equilibrio umorale, che va in iper-produzione di anticorpi che però non distruggono il parassita. Questa iperproduzione è alla base dei processi patologici della malattia, nei quali si osservano:

Iperglobulinemia con disprotidemia
Produzione di autoanticorpi
Produzione e deposito di immunocomplessi
Immunodepressione
Granulomatosi diffusa

Carica parassitaria

Anche la carica parassitaria riveste un ruolo cruciale nella progressione della leishmaniosi canina. In presenza di elevate quantità di agenti infettivi o parassiti, il sistema immunitario tende naturalmente a polarizzarsi verso una risposta di tipo umorale, fenomeno osservato in diverse malattie fungine, batteriche e protozoarie come istoplasmosi, brucellosi, tubercolosi e lebbra. Questo meccanismo potrebbe rappresentare una reazione protettiva, poiché un'eccessiva immunità cellulo-mediata in presenza di un'elevata carica antigenica potrebbe risultare autodistruttiva.

Nel caso specifico della leishmaniosi canina, una carica parassitaria più elevata si traduce in una progressione più rapida e forme cliniche più gravi della malattia. Studi in corso presso la Clinica Veterinaria San Marco hanno evidenziato una correlazione tra carica parassitaria e livelli di parametri infiammatori come le proteine di fase acuta. Inoltre, è stata riscontrata una correlazione statistica tra la magnitudine della carica parassitaria e il tasso di mortalità.

Pertanto, la quantificazione della carica parassitaria rappresenta un elemento fondamentale nell'inquadramento clinico e prognostico dei casi di leishmaniosi canina, poiché livelli elevati di parassitemia sono associati a una maggiore gravità della patologia e spesso a un peggior esito clinico.

Altri fattori predisponenti

Genetica: razze come Boxer, Pastore Tedesco e Rottweiler sono più sensibili alla malattia.

Età: gli animali sensibili si ammalano spesso alla prima esposizione ai flebotomi, attorno all'anno di vita, o in età avanzata per una riduzione delle difese immunitarie.

Patologie concomitanti: infezioni multiple trasmesse da vettori, come l'ehrlichiosi, o altre malattie infiammatorie o neoplastiche possono interferire con il contenimento dell'infezione.

Infestazioni da ectoparassiti: le infestazioni da zecche determinano una risposta infiammatoria umorale che facilita la progressione della malattia.

Terapie: l'uso di farmaci immunosoppressivi, specialmente se utilizzati per trattare presunte malattie autoimmuni che sono in realtà manifestazioni di leishmaniosi clinica, favorisce lo sviluppo della malattia.

TEST DIAGNOSTICI E INTERPRETAZIONI

Alterazioni ematochimiche : esame emocromocitometrico, chimica clinica e sieroelettroforesi

Le alterazioni maggiormente segnalate sono

anemia da lieve a moderata, non rigenerativa, normocita e normocromica
neutrofilia, associata o meno a linfocitosi o linfopenia
lieve/moderata trombocitopenia
iperprotidemia con aumento delle globuline alfa-2, beta e gamma, riduzione delle albumine sieriche, e del rapporto A/G

Questo tipo di alterazioni sono però piuttosto aspecifiche e possono risultare come conseguenza dell’attività secretoria delle plasmacellule, variabili a seconda del soggetto, dell’eventuale stadio della malattia, e di altri fattori conseguenti allo stato infiammatorio cronico sistemico, come le concomitanti insufficienze renali con proteinuria spesso irreversibili anche in corso di trattamento., o di patologie concomitanti rickettsiosi, anaplasmosi, ehrilchiosi etc. che aumentano le globuline circolanti.

Proteine fase acuta

La rilevazione delle proteine di fase acuta (APP) e l’elettroforesi delle sieroproteine sono di supporto alla diagnosi e al monitoraggio. Il quadro elettroforetico è di ipoalbuminemia, incremento alfa2 globuline, ipergammaglobulinemia e rapporto A/G diminuito.

Sebbene non sia specifico della Leishmaniosi, riflette l’entità della risposta infiammatoria e individua alcune differenze con altre patologie, come l’aumento di ferritina circolante, per anomalie metabolismo del ferro. Esprimendo la gravità della malattia, si riducono in terapia, se efficace.

Esame delle urine e valutazione della proteinuria

La deposizione di immunocomplessi a livello glomerulare porta anefropatia proteinurica, con conseguente insufficienza renale cronica.

Per questo vengono valutate e monitorate la proteinuria, la creatinina, l’urea e il peso specifico, utile per avere indicazioni precoci relative alla localizzazione del danno tubulare o glomerulare.

Sierologia

Gli esami sierologici consentono di identificare gli anticorpi specifici generati in risposta a un'infezione, con una produzione significativa che si verifica solitamente tra i 3 e i 6 mesi dall'infezione. Esistono due tipi principali di test: i test rapidi qualitativi, che forniscono un risultato positivo o negativo, e i test quantitativi, che misurano il livello specifico di anticorpi presenti nel sangue.

I test rapidi, come quelli basati sul metodo ELISA o su tecniche immunocromatografiche, sono semplici da utilizzare in ambulatorio. Sebbene abbiano una specificità elevata, la loro sensibilità è piuttosto bassa. Questi test sono particolarmente utili nella pratica quotidiana, ma è importante sottolineare che sono progettati per rilevare livelli medi o elevati di anticorpi. Pertanto, sono più adatti per confermare un sospetto di malattia piuttosto che per screening preventivi, come prima di una vaccinazione contro la leishmaniosi in animali clinicamente sani, dato che potrebbero risultare falsamente negativi se gli anticorpi presenti sono a basso titolo.

Per quanto riguarda i test quantitativi, le due principali tecniche sono l'immunofluorescenza indiretta (IFI) e il test ELISA. L'IFI può essere soggetta a variabilità in base all'operatore e può presentare limitazioni in termini di sensibilità e riproducibilità. Il test ELISA, d'altra parte, è considerato più affidabile e oggettivo, privo di significativi problemi tecnici e, quindi, è raccomandato come metodo di prima scelta. Nel nostro laboratorio, utilizziamo il metodo ELISA da oltre vent'anni, avendo apportato modifiche che ne migliorano significativamente l'affidabilità.

È importante notare che livelli elevati di anticorpi sono generalmente associati a forme più gravi della malattia e possono quindi essere utili nella stadiazione della patologia. Tuttavia, sia i test qualitativi che quantitativi richiedono un'interpretazione cauta: un risultato positivo non è sempre indicativo di malattia attiva. È consigliabile confermare i risultati attraverso metodi di rilevazione diretta dell'agente patogeno prima di formulare una diagnosi definitiva.

Infine, il laboratorio offre la determinazione del rapporto tra linfociti CD4 e CD8 , anche se probabilmente sarebbero necessari ulteriori studi per poterla utilizzare routinariamente in ambito clinico.

Biologia Molecolare

La PCR rappresenta un metodo sensibile e specifico per la quantificazione della carica parassitaria, un esame di grande importanza sia in fase diagnostica, per stadiare il paziente, sia per il monitoraggio terapeutico a breve termine

La scelta del substrato per la PCR (midollo osseo, milza, linfonodi o sangue periferico) dipende dalle condizioni cliniche del paziente.

Monitoraggio

Durante il trattamento diversi test precedentemente descritti vengono impiegati per monitorare l'efficacia della terapia, lo stato di salute del paziente e l'evoluzione dell'infezione.

Per valutare lo stato dell'infezione, la sierologia (test ELISA quantitativo) può essere eseguita non prima di 6 mesi dalla fine della terapia, al fine di permettere un riassestamento dell'attività plasmacellulare coerente con la carica parassitaria effettiva

Per approfondire gli aspetti diagnostici come descritti nella letteratura corrente, si invita a consultare le eccellenti review del gruppo Leishvet.

Conclusione

In conclusione, la leishmaniosi canina è una patologia complessa che richiede un approccio diagnostico integrato, combinando diversi test di laboratorio. L'interpretazione dei risultati deve tenere conto dei fattori che influenzano la risposta immunitaria, come la carica parassitaria, lo stadio della malattia e la presenza di patologie concomitanti.

Tutti questi aspetti sono oggetto di numerosi studi, che verranno presentati e approfonditi durante la prima giornata della JamSession

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