Esami laboratorio: Esami genetici in Oncologia - Clonalità linfoide

Per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma sono adesso a disposizione dei test genetici di grande interesse. Queste indagini permettono di rispondere ai seguenti quesiti:

E’ un linfoma?
Non sono rari i casi in cui l’esame citologico non è in grado di fornire un grado adeguato di certezza, ad esempio in caso di estrema fragilità cellulare, oppure quando sono stati incongruamente utilizzati dei cortisonici prima di raggiungere la diagnosi. In questi casi si possono utilizzare i preparati citopatologici dai quali si sospetta la proliferazione linfomatosa e richiedere un test di clonalità linfoide. In caso di linfoma il referto fornirà una diagnosi di monoclonalità di tipo T o B.
Nel nostro referto quindi dovrete ricercare la presenza o meno della monoclonalità. Di sotto vedete un esempio di diagnosi positiva per linfoma B.
Nel referto può anche essere indicato che esiste una oligoclonalità: in questo caso il significato clinico è quello di aver individuato una reattività ma non una condizione di linfoma.


Quale è il fenotipo? B o T?
Esistono due fenotipi, T o B. Il fenotipo è un fattore prognostico rilevante, considerando che i linfomi T si associano a una minore percentuale di risposta ed un minore tempo di remissione e di sopravvivenza. Ad esempio, utilizzando un protocollo con doxorubicina, derivato dal CHOP, la sopravvivenza per i linfomi B è di 12-16 mesi, mentre è di 4-6 mesi per i linfomi T. Esistono comunque dei casi particolari, ad esempio nel linfoma a piccole cellule (di fenotipo T), nei quali il grado di malignità è comunque basso. Per tale motivo la determinazione del fenotipo deve essere sempre associato ad una adeguata classificazione morfologica.
Come prima indicato, il test di clonalità linfoide fornisce un’indicazione precisa del fenotipo. Rappresenta una metodica alternativa al test citofluorimetrico che si realizza con una sospensione di cellule linfonodali in una provetta che contiene un apposito preservante.

E’ possibile eseguire un monitoraggio della chemioterapia ? E’ possibile individuare la recidiva dopo chemioterapia prima della comparsa dei sintomi ?
La ricerca della malattia minima residua (MMR) è una delle applicazioni piu’ interessanti ed innovative della genetica in ambito oncologico. In particolare, nel caso del linfoma è possibile individuare nel sangue periferico la ricomparsa del clone neoplastico prima della recidiva clinica (ad esempio prima della ricomparsa della linfoadenomegalia). Per poter eseguire una valutazione della MMR è necessario aumentare la specificità; l’iter diagnostico è analisi di clonalità “tradizionale” con primer per regioni consenso, quindi se si isola un riarrangiamento clonale si procede con il sequenziamento e il disegno di primer definiti paziente-specifici che amplificano solo il clone in questione. Se si vuole utlizzare la genetica per la valutazione della MMR si dovrebbe richiede il sequenziamento e il disegno dei primer pazienti-specifici prima di iniziare la chemioterapia. Successivamente si andra’ a richiedere solo la ricerca del clone, da noi individuato e conservato nella banca dati. Ovviamente si dovra’ informare il Laboratorio che si sta eseguendo un monitoraggio di un paziente precedentemente già studiato. Importante: (al momento) il monitoraggio si puo’ eseguire esclusivamente nei linfomi B

I test di clonalità linfoide sono sempre corretti e definitivi ?
Al pari di qualsiasi altra indagine diagnostica, non possiamo attribuire una sensibilità e specificita’ del 100% alle prove di clonalità linfoide. Inoltre essendo una metodica nuovissima esiste senz’altro ancora un margine di miglioramento e ottimizzazione. In linea generale potremmo associare ai test genetici una sensibilità del 70-90% (si intende la capacità del test di individuare i casi di linfoma) e una specificità del 95% (si intende il grado di sicurezza quando un test e’ positivo).

Di seguito proponiamo alcune informazioni recentemente raccolte da Bienzle e Vernau [The Diagnostic Assessment of Canine Lymphoma, Clin Lab Med 31 (2011) 21–39], relativi ai falsi positivi e falsi negativi.

Perchè si osservano dei falsi negativi [il test fornisce un quadro di policlonalità, mentre il paziente è affetto da un linfoma]?
– I set di primer ad oggi disponibili non possono coprire tutti i riarrangiamenti che si possono verificare nei linfomi.
– Esistono delle ipermutazioni somatiche in geni già riarrangiati di alcuni linfomi B.
– Abbiamo notato in soggetti già trattati con quadri citologici di frammentazione nucleare (nuclei nudi, apoptosi, necrosi massive) e linfonodi ancora aumentati di volume, la possibilità di falsi positivi con i primer consenso.
– E’ già stato segnalato che nelle leucemie B a piccole cellule possono verificarsi dei falsi negativi. Importante: il test è validato solo per il linfoma.

Perche’ si osservano dei falsi positivi ?
– Utilizzo del gene per la catena gamma del recettore dei linfociti T (TCRG), che presentano minore diversità giunzionale. Per ovviare a questo problema si devono utilizzare diverse tecniche quali: single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), heteroduplex analysis (HDA) e gene scanning technolologies
– Fenomeni di pseudoclonalità. Solitamente si osservano in caso di DNA di scarsa qualità o di DNA con un template limitato. Infine è stata descritta anche la possibilità che l’eosina presente nei campioni istopatologici possa determinare un picco clonale

In conclusione, allo stato attuale delle conoscenze, la valutazione della clonalità linfoide presenta ancora delle limitazioni per essere considerato un test conclusivo e pertanto i risultati devono essere valutati contestualmente a valutazioni cliniche, morfologiche e immunofenotipiche. Il trend anche in medicina umana è però di affidare sempre piu’ peso a questi test ed in futuro prossimo potranno apportare un peso diagnostico e prognostico ancora più importante.

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