Esami laboratorio: Istopatologia e immunoistochimica

Novità 2019: E’ attivo il nuovo servizio di ISTOPATOLOGIA RAPIDA – CON REFERTAZIONE IN GIORNATA [dettagli]

 

Vi segnaliamo che per ottenere una valutazione dei margini, ad es. in caso di rimozione di sospette masse tumorali, si deve richiedere tale prestazione già in fase iniziale di richiesta (ovvero richiedere “esame istopatologico con valutazione dei margini”). La valutazione dei margini implica una processione del campione più complessa e pertanto impone un aumento del costo della lettura istopatologica (per ulteriori dettagli vedere sezione Margini)
Abbiamo preparato anche delle istruzioni relative all’invio di campioni multipli provenienti dallo stesso paziente (vedi sotto)
I campioni cutanei, per lo studio di malattie non neoplastiche, hanno un registro dedicato e devono  essere richiesti nel sito sotto la voce istopatologia cutanea.

Preparazione dei campioni

La preparazione di un campione destinato all’istopatologia è un atto medico di grande importanza. Se il campione è inadatto o mancano dati, il referto istopatologico potrebbe esserne condizionato e risultare, al meno in parte, generico.
Di seguito sono elencati tutti i punti fondamentali per la buona riuscita di un esame istopatologico: FISSAZIONE DEL CAMPIONE ISTOLOGICO: Dopo il campionamento i prelievi devono essere posti il più rapidamente possibile in adeguata quantità di formalina al 10% (corrispondente ad una soluzione di formaldeide al 4%).
La fissazione del campione è un altro aspetto fondamentale dell’esame istologico: tanto più velocemente avverrà, tanto minori saranno gli artefatti. In questo senso, il rapporto ottimale tra il volume di formalina e del campione è di 9:1 – 10:1. Difficilmente tale rapporto potrà essere raggiunto per campioni di grandi dimensioni, tuttavia è assai consigliabile che il campione sia immesso in un contenitore che ne permetta la libera fluttuazione nel fissativo; evitare di inserire campioni in barattoli di dimensioni appena sufficienti in quanto la fissazione sarà decisamente più lenta e inoltre, durante la fissazione, il campione aumenta di consistenza, rendendo da un lato difficoltosa l’estrazione dal contenitore stesso, dall’altro impedendo al fissativo di raggiungere le porzioni più interne.
È importante ricordare inoltre che la formalina in generale penetra i tessuti ad una velocità di circa 1 mm all’ora, da ciò consegue che campioni di eccessive dimensioni (o fissati con scarsa formalina) saranno solo parzialmente fissati (esaminabili) e aumenterà il rischio di autolisi (non esaminabili). Se il campione viene inviato dopo aver effettuato la fissazione subito dopo il campionamento utilizzando un volume di formalina adeguato, è comunque utile utilizzare barattoli da trasporto che contengano anche minime quantità di formalina, evitando così rischi di essicazione.
CONTENITORI : Il barattolo deve avere ampia imboccatura e va accuratamente chiuso per evitare perdite di liquido (si ricorda che la formalina è una sostanza cancerogena ed altamente tossica, pertanto per la sicurezza dell’ambiente e di tutti gli operatori che verranno a manipolarlo si consiglia vivamente l’utilizzo di contenitori dedicati).
Il contenitore deve riportare esternamente, in modo chiaro tutte le informazioni utili all’identificazione univoca dello stesso (Es. cognome del proprietario, nome dell’animale, tessuto d’origine)

CAMPIONI DI GRANDI DIMENSIONI: Se il campione è voluminoso e difficile da spedire in toto è possibile che il medico veterinario che ha manipolato e conosce il pezzo chirurgico decida quali siano le porzioni più rappresentative da sottoporre ad esame.
Ove non necessario tuttavia è consigliabile che sia il patologo a campionare la lesione da destinare ad esame istologico. L’esame macroscopico della lesione è infatti parte integrante dell’esame anatomopatologico.
CAMPIONI MULTIPLI: Possono essere inviati più prelievi separati, oppure anche nello stesso contenitore se opportunamente contraddistinti (fili, punto di sutura, ago infisso), riportando nel modulo di richiesta indicazioni precise e riferimenti per ogni campione. Si consiglia di indicare il numero di campioni inviati.
RICHIESTA: All’atto della richiesta compilare sempre i dati richiesti. Si prega di riportare il maggior numero di indicazioni cliniche possibile. È fondamentale un completo segnalamento dell’animale ed un’esaustiva descrizione morfologica della lesione e dei suoi tempi di evoluzione, delle modalità di campionamento, al fine di ottenere un referto maggiormente completo.
VALUTAZIONE DEI MARGINI: Una particolare attenzione deve essere destinata alla valutazione dei margini: in molti stati proliferativi è fondamentale avere informazione sull’eventuale presenza di elementi neoplastici nel margine chirurgico. Se il chirurgo ritiene utile orientare il campione, questo può essere ottenuto con un singolo punto in una posizione nota (ad esempio, segnando il margine craniale di una massa al fianco sinistro, questa sarà perfettamente orientabile in ogni suo punto). Altri metodi di segnalazione dei margini prevedono l’utilizzo di coloranti specifici o anche normale inchiostro di china o infine una soluzione 1:1 di acetone ed inchiostro di china. Va da sé che l’esame dei margini richieda un maggior numero di sezioni, di vetrini e un maggior lavoro da parte del patologo, pertanto anche i costi di tale esame sono forzatamente superiori rispetto all’esame istopatologico “tradizionale”. E’ indispensabile richiedere l’esame dei margini prima che il campione venga manipolato in laboratorio.
TEMPI DI REFERTAZIONE: I tempi di risposta attesi per un esame istologico standard sono in genere di 3-4 gg. lavorativi (per il mese di dicembre 7 gg lavorativi) dal ricevimento del campione. In alcuni casi sono necessari tempi più lunghi, ad esempio nel caso di campioni non ancora ben fissati, per i quali sia necessaria una post fissazione o per campioni da sottoporre a decalcificazione. in più se per ragioni di accuratezza diagnostica si rendano necessarie delle colorazioni speciali aggiuntive (PAS, Congo-Red), blu di toluidina), oppure l’esecuzione di ulteriori sezioni all’EE. Il medico veterinario che ha inviato il campione può comunque in ogni momento contattare il reparto di anatomia patologica attraverso il laboratorio, in modo da avere i chiarimenti del caso.
Dopo il ricevimento del risultato, sono benvenuti commenti e richieste di chiarimenti. Per qualsiasi comunicazione, puntualizzazione o precisazione è possibile contattare telefonicamente o per e-mail il Laboratorio, che lo indirizzerà al responsabile del servizio di anatomia patologica.
Lo staff del repart di anatomia patologica è costituito dal Dott. Marco Rondena, MedVet, ECVP Dip, Dott.ssa Valeria Baldassarre, MedVet ECVP Dip, Dott.ssa Giorgia Mezzalira MedVet, PhD, Dott.ssa Valentina Giacobbi, MedVet e Stefania Gasparini, MedVet, resident ECVP

Riportiamo di seguito un breve prospetto sui costi degli esami istopatologici nel caso in cui vengano inviati più campioni.
A – Viene addebitato il costo di un solo campione nel caso vengano inviati:
1. Fino a 3 campioni provenienti da un solo paziente.
2. Biopsie, anche più numerose di 3
a. Provenienti dallo stesso organo di uno stesso paziente
b. Ottenute da uno stesso apparato mediante esame endoscopico (es. biopsie di piccole dimensioni prelevate durante l’esame endoscopico dei vari tratti dell’apparato digerente).
B – Viene addebitato il costo di un campione
a. Per i campioni che ricadono nei punti 1 e 2 del paragrafo A.
b. Per ogni 3 organi esaminati provenienti dall’esame necroscopico di uno stesso paziente.
C – Esame dei margini
Nel caso in cui venga richiesta la valutazione dei margini di campioni neoplastici il costo dell’esame istopatologico è maggiorato. Questa maggiorazione è legata alla particolare preparazione a cui deve essere sottoposto il campione per una corretta valutazione.

ESAMI

Istologico

Campione in formalina o blocchetti; non refrigerato. Refertazione in 3-4 giorni ma è possibile richiedere la refertazione RAPIDA (in giornata).

Esame istologico con valutazione dei margini

Scheda approfondimento: ESAME DEI MARGINI

Studio Istopatologico per biopsie cutanee

Campione in formalina o blocchetti; non refrigerato. Refertazione in 7 giorni.

Scheda approfondimento: dermatoistopatologia

Colorazione speciale

Da richiedere dopo esame istopatologico.

Esame istologico biopsie gastro-intestinali immunoistochimica pannello enteropatia

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

Scheda approfondimento: IMMUNOISTOCHIMICA

Esame immunoistochimico per neoplasie (singolo anticorpo)

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico.

Scheda approfondimento: IMMUNOISTOCHIMICA

La colorazione immunoistochimica nel nostro laboratorio è ad oggi effettuata mediante l’utilizzo del coloratore automatico Leica Bond, al fine di ottenere la maggiore standardizzazione e ripetibilità dei risultati.

Il nostro laboratorio dispone di un vasto parco anticorpi, in continua evoluzione ed integrazione, in questa pagina sono riportati i pannelli maggiormente utilizzati, sarà quindi nostra cura provvedere ad aggiornare la pagina con le novità più recenti. La colorazione immunoistochimica è comunque una tecnica dinamica e pertanto può essere considerata su misura per il campione. In questo senso ci possono essere delle piccole differenze, caso per caso, segnalate e suggerite in sede di commento al referto istologico di pertinenza. Un’ultima considerazione riguarda il fatto che il dinamismo citato dipende altresì dalla letteratura, in pratica in seguito a studi pubblicati che prevedano l’utilizzo di sieri nuovi per la diagnosi di una data malattia, questi verranno applicati da parte del laboratorio nel più breve tempo possibile.

Immunoistochimica malattie infettive: Leishsmaniosi – Cimurro – Coronavirus Felini e altri

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

Immunoistochimica: Neoplasia indifferenziata maligna

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

In questo caso, il quadro istologico è tale per cui non è possibile definire con certezza la cellula (epiteliale vs mesenchimale) di origine della neoplasia. In verità, tale caso, è assai raro. Più comunemente, la necessità di indagare la cellula di origine della neoplasia, si ha quando tra le differenziali è posta anche la diagnosi di melanoma amelanotico: quest’ultima neoplasia è infatti priva di pigmento, molto pleomorfa e non così raramente responsabile di dubbi diagnostici.

Citocheratina AE1/AE3 – Vimentina – Melan A/PNL2– S100 verrà sostituito con PNL2.

Immunoistochimica: Neoplasia epiteliale / epiteliale ghiandolare

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

Nel caso del carcinoma, il tessuto di origine è chiaro (epitelio), ma talora, nei carcinomi originanti a livello cutaneo, si pone la necessità di evidenziare la citocheratina maggiormente espressa da parte delle cellule neoplastiche, in modo da poter definire l’origine follicolare pilifera rispetto a ghiandolare (normalmente, in corso di carcinoma con elevata componente solida a cellule basali). Il medesimo pannello può essere sfruttato anche nel caso di carcinomi, a prominente componente solida, che coinvolgano gli organi del cavo addominale o toracico, come per esempio i tumori epatici, pancreatici o, talora originanti nello spazio retro peritoneale

Citocheratina AE1/AE3 – Citocheratina 7– citocheratina 8/18.

Immunoistochimica: Neoplasia neuroendocrina – neuroepiteliale

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

NB: le neoplasie di origine neuroendocrina o endocrina, presentano talora, soprattutto quando sono comprese in organi interni, difficoltà diagnostiche nei riguardi dei carcinomi a piccole cellule, soprattutto. In questo caso il pannello immunoistochimico proposto è: citocheratina AE1/AE3, cromogranina A, NSE, sinaptofisina.

Immunoistochimica: Neoplasia rotondo cellulare

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

NB: In questo caso non è definibile, sulla solo base istologica, la cellula neoplastica di origine, per cui vi è la necessità di differenziare la possibile origine linfoide o istiocita ria della neoplasia.

CD3-CD20-Iba1-CD117.

Immunoistochimica: Neoplasia di origine linfoide

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

NB: In questo caso la diagnosi è ristretta ad una forma linfoma tosa, tuttavia, su base morfologica, non è possibile sempre stabilire se un linfoma sia di tipo T o B

CD3-CD20.

Immunoistochimica: Mastocitoma

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

NB: Negli ultimi anni, questa neoplasia, specialmente nella specie canina è stato oggetto di numerose indagini, tanto che ne è stata proposta, di recente, una nuova classificazione (Kiupel et al.). Immunoistochimicamente, in base a tali studi, le indagini che si possono effettuare per scopi prognostici riguardano il pattern di espressione di CD 117 (kit) e l’espressione di Ki67 in rapporto all’indice di organizzatori nucleolari stabilito mediante colorazione argentica AgNOR. Il profilo in questo caso è pertanto ibrido, di tipo istochimico/immunoistochimico e comprende, AgNOR, CD117 (kit) e il Ki67.

Immunoistochimica: Sarcoma vs Melanoma

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

Il melanoma specialmente se amelanotico spesso presenta caratteristiche citomorfologiche ed architetturali sovrapponibili a molte neoplasie mesenchimali, per cui si rende necessario un approfondimento immunoistochimico tramite anticorpi specifici quali: Melan A, PNL2 o S100 e Vimentina.

Immunoistochimica: Sarcomi dei tessuti molli (PMNST, tumori perivascolari, fibrosarcoma)

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

I sarcomi sottocutanei sono, tra i tumori di origine mesenchimale, quelli che più frequentemente presentano pleomorfismo nonché caratteristiche morfologiche in parte sovrapponibili e che quindi devono essere differenziate mediante immunoistochimica. Tra queste si pongono spesso problemi differenziali, nel cane, tra i tumori della parete vascolare e delle guaine dei nervi periferici. I primi appaiono spesso esprimere proteine contrattili tipici della muscolatura liscia, come Actina muscolare liscia e Desmina, mentre i secondi reagiscono assai di frequente ad S 100 e, più raramente, ma più specificamente, con GFAP. In questo caso il pannello proposto è il seguente: Vimentina, Actina mscolare liscia, Desmina, GFAP, S100.

Immunoistochimica: Sarcomi scarsamente differenziati (comprendenti tra le differenziali le origini endoteliale e istiocitaria)

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

In particolare alcuni sarcomi dermici e sottocutanei di tipo epitelioide, devono far considerare come seconda diagnosi differenziale quella di una forma istiocitaria o melanocitaria.

In tali casi il pannello proposto è: Vimentina, Actina muscolare liscia, GFAP, MelanA/PNL2 Fattore VIII, Iba1.

Immunoistochimica: Sarcomi scarsamente differenziati (muscolare vs endoteliale)

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

Sebbene raramente, nel corso del flusso diagnostico istologico, i sarcomi originanti in sede muscolare striata scheletrica possono presentare alcuni aspetti morfologici tali da rendere dubbia la diagnosi. Questo è il caso, ad esempio, delle neoplasie vascolari che presentano aspetto epitelioide che sono poste in diagnosi differenziale con il rabdomiosarcoma. In tali casi si rende necessaria una loro differenziazione tramite colorazione immunoistochimica.

In tale caso il pannello proposto è: Vimentina, Fattore VII, Actina muscolare liscia, Desmina, Actina sarcomerica.

Immunoistochimica: Sarcomi muscolari

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

NB: Le neoplasie di origine muscolare spesso presentano morfologia simile, soprattutto quando queste sono maggiormente indifferenziate. In questi casi è utile differenziare l’origine delle cellule neoplastiche tra muscolari lisce e muscolari striate. Le cellule muscolari hanno un fenotipo simile tra loro, sia per quanto riguarda la muscolatura liscia che striata, tuttavia, alcune proteine sono espresse solo nel muscolo striato, ed altre, come la actina (proteina contrattile coinvolta nell’attività della cellula muscolare), presentano differenti isoforme nelle due diverse cellule muscolari. La differenziazione fenotipica delle cellule muscolari, può quindi essere basata su un pannello di anticorpi in grado di riconoscere le diverse isoforme delle proteine contrattili, oppure determinare la presenza di proteine tipiche del muscolo striato.

Il pannello suggerito, nei presenti casi è: Actina muscolare liscia, Actina sarcomerica, Desmina.

Immunoistochimica: Leiomiosarcoma vs GIST

Sezioni istologiche successive e seriate direttamente dallo stesso blocchetto già utilizzato per l’esame istologico. Refertazione in 3-4 giorni.

In molti casi, le neoplasie di origine muscolari liscia (leiomiosarcoma), che originano a livello dell’apparato gastrointestinale, nel cane, presentano morfologia smile ad un’altra neoplasia, che si sviluppa nell’ambito della parete enterica: il tumore gastrointestinale stromale. Questa neoplasia a cellule fusate, origina da elementi cellulari sparsi nello stroma della sottomucosa: le cellule di Cajal. Queste cellule hanno un particolare fenotipo, che comprende l’espressione di S100 e, soprattutto, CD117. L’utilizzo di anticorpi in grado di marcare tali molecole permette, quindi la differenziazione tra GIST e leiomiosarcoma.

Il pannello immunoistochimico suggerito, in questo caso è: Vimentina, Actina muscolare liscia, S100, CD117.